AAV在眼睛中的靶向策略
由于具有合适的疾病治疗靶点、解剖学上的可及性、免疫赦免特性以及与全身血液循环的相对独立等特点，眼睛一直处于基因治疗的前沿。AAV作为眼科研究与眼病基因治疗的理想载体，其介导的基因传递在多种遗传性和获得性视网膜疾病动物模型中已被证明高度有效，此外，眼局部精准用药，AAV用量少，安全性更高，且疗效持续，成本更低。
图1. Luxturna采用AAV2递送正常的RPE65基因进入RPE细胞
视网膜为一层柔软而透明的膜，紧贴在脉络膜内面，能够感受光刺激。视网膜主要由视网膜色素上皮细胞（RPE）、视杆细胞、视锥细胞、米勒胶质细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、神经节细胞（RGC）等细胞类型组成。
图2. 视网膜的解剖结构
（Peters, C.W., et al. Trends Pharmacol Sci, 2021.）
实现AAV在眼睛中的高效及特异性表达，需要对AAV载体系统进行优化，一般从以下几方面着手考虑：AAV载体设计（启动子、调控元件及AAV载体类型的选择）、AAV血清型、AAV注射方式。
图3. AAV介导视网膜基因转移的优化策略
（Schon, C., M. Biel and S. Michalakis. Eur J Pharm Biopharm, 2015.）
一、启动子的选择
选择合适的转基因启动子对于AAV转导视网膜的效率和细胞特异性具有重要意义。CMV/CBA/CAG启动子可以驱动基因在眼睛中的高水平表达。若想实现在RPE细胞中的特定表达可选择RPE65和VMD2启动子，二者均为RPE特异性启动子。
二、AAV血清型及给药途径选择
在眼部研究中，AAV2、AAV5、AAV8和AAV9都可以有效转导，AAV 7m8、AAV rh10、AAV Anc80L65、AAV PHP.B等血清型也被证明可有效转导视网膜细胞，此外，不同的注射方式也会影响AAV载体对细胞的转导效果和能力。因此在实际应用中可结合AAV注射途径及启动子进行优化选择。
图4. 不同AAV血清型对不同视网膜细胞的特异性（视网膜下注射）
（The gene therapy renaissance: How experimental technique overcame a troubled legacy and is now helping the blind to see）
图5. 小鼠和灵长类动物几种血清型受体、供受体及细胞趋向性（视网膜下注射）
（Marcela Garita-Hernandez et al. Int J Mol Sci. 2020）
AAV载体介导的眼部基因转导根据治疗目的不同，有玻璃体腔注射、视网膜下腔注射、前房注射、角膜基质注射等，其中较常用的是玻璃体腔注射（IVT）和视网膜下注射（SR）。
图6. 视网膜的两种给药途径
（Peters, C.W., et al. Trends Pharmacol Sci, 2021.）
IVT是将药物直接注入眼球玻璃体腔内，侵袭性较小、术后并发症较少，但由于内界膜ILM的存在，大多数AAV血清型无法传递至RGCs之外的细胞内。
玻璃体腔注射较适用于视网膜神经节或Müller神经胶质细胞的靶向。此种注射方法会产生针对AAV衣壳蛋白的体液免疫反应，这种反应可阻碍再次注射时AAV的表达，如果两只眼都需要连续治疗的话，需要避免使用这种注射方式。
· 小鼠玻璃体腔注射步骤 ·
1、麻醉：4.3%水合氯醛 0.01ml/g ；
2、散瞳：建议双眼散瞳，以防一眼出现意外时可以迅速换眼；
3、甲基纤维素保持眼表湿润；
4、抗生素眼药水、表麻药术前滴眼；
5、调整小鼠头位，让小鼠眼球保持角膜缘水平位；
6、注射位置：理论上是角膜缘后1mm，也有选择在颞侧进行，注意避开血管。白鼠还可以看见视网膜血管，需避开。
7、注射切口：推荐使用ALCON的10-0针做切口，非常整齐，33G的针进去水密非常好。也可以用破囊针。切口越整齐，跟针越匹配，越不易渗漏；
8、注射进针：针尖垂直进入，随后倾斜。这一步非常关键，小鼠眼球小，晶体球形，倾斜角度小了会损伤晶体，大了会扎上视网膜，出血；
9、注射：缓慢推注，无阻力。迅速推注的话取材时会发现视网膜散在出血点，可能干扰试验结果。推针以后留针0.5-1min，迅速出针。
SR是将药物注入光感受器细胞和RPE之间的视网膜下腔，这需要使视网膜的神经上皮层与色素上皮层分离，形成视网膜下腔。SR是将基因直接递送至RPE细胞或光感受器细胞的有效方法，但此方法侵入性较大，容易使视网膜脱离，可能会引起胶质细胞增生、光感受器退化及视力功能损伤等，并且药物扩散有限只能实现局部转导。
视网膜下腔注射，主要转染视网膜色素上皮细胞和光感受器细胞，不会触发体液免疫反应，对另一只眼再次视网膜下注射也无影响。
图7. 视网膜下注射方式
(https://www.pharmacology.cup.uni-muenchen.de/research/retinal_gene_therapy/index.html)
· 小鼠视网膜下腔注射步骤 ·
1、麻醉：对于成年小鼠，异氟醚吸入麻醉或联合使用氯胺酮（100mg/ml）和赛拉嗪(20mg/ml)按照0.1ml/10g腹腔注射; 对于围产期小鼠，异氟烷吸入麻醉或低温麻醉；
2、使用Vannas直剪沿着闭合的眼睑裂开大约1.5 mm的切口；注意切口不要太大；
3、用弯曲的敷料钳将眼皮分开，以支撑眼睛，并在眼睛下方稍微捏紧眼皮，将其拿起以供注射；
4、在眼球中纬线或中纬线后方做一个小的巩膜切口，切口够注射针尖端通过即可；
5、小心地将注射针插入切口部位，并平行于眼外壁进入视网膜下腔；
6、开始注射，如果正确注射至视网膜下腔，能感受到适度的阻力；缓慢出针，可将针头固定15s，避免注射病毒回流到切口位置；
7、使用弯曲的敷料钳轻轻地将眼睛推回眼眶；将适量0.25%布比卡因，滴在注射部位；
8、小鼠苏醒后置于加热垫上，整个注射过程控制在5min内完成；
9、小鼠恢复活动能力后放回鼠笼。
两种注射方式的比较
在某些情况下，也需要根据疾病的性质选择合适的注射方式，下面总结了某些眼部临床疾病适用的注射方式，在多种注射方式均可以的情况下，可以根据方便程度等合理选择。
图8. 常见眼部疾病及给药途径
（https://bioheights.com/aav-route-of-administration/）
· 温馨提示 ·
推荐的注射病毒量在10E7-10E10VG（请根据具体实验参考相关文献） 。
三、转录后调控元件的选择
调控元件可以增加转录本的稳定性，从而提高蛋白表达水平。WPRE（土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件）可显著增加外源片段的表达效率。将WPRE掺入rAAV携带基因的3’UTR区，可增加mRNA的表达水平和翻译效率进而增强转基因表达。WPRE序列较长（600 bp），因而只能用于其它基因元件较小的rAAV载体。
四、scAAV载体的选择
ssDNA AAV基因组互补链的合成是AAV介导外源基因表达的限速步骤，scAAV能够克服这一限制，不需要经历一个由单链变为双链的过程，有文献表明，在视网膜的各种细胞类型中，特别是RPE和光感受器中，scAAV转导可以完成目的基因的更快及更强表达。因此在包装容量允许的前提下，可以选择scAAV载体。
图9. scAAV2/8相比ssAAV2/8介导了基因的更早及更强表达
（Natkunarajah, M., et al.Gene Ther, 2008.）
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